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蛋白印跡儀:蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定的有效工具

發(fā)布日期: 2024-11-25
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  蛋白印跡儀,也稱為Western Blot儀器,其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度,可以獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。
 
  核心步驟:
 
  蛋白質(zhì)電泳分離:利用電泳技術(shù)將細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)分離。
 
  轉(zhuǎn)膜:將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上,如硝酸纖維素薄膜(NC膜)或PVDF膜。
 
  封閉:使用封閉液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。
 
  抗體孵育:將特異性抗體與膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育,使抗體與目的蛋白質(zhì)結(jié)合。
 
  顯影:通過底物顯色或熒光成像等手段,檢測與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。
 
  操作使用需要注意哪些事項?
 
  1、抗體選擇:一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結(jié)合抗原能力較強(qiáng)、靈敏度高,但易產(chǎn)生非特異性的背景;單克隆抗體識別抗原特異性較好,但可能不識別在樣品制備時因變性而失去了空間構(gòu)型的抗原表位。因此,在選擇抗體時需要根據(jù)實驗需求進(jìn)行權(quán)衡。
 
  2、膜的選擇:一般情況使用0.45μm的NC膜,0.1~0.2μm的小孔徑膜只適合于分子量小于20kD的蛋白質(zhì)。PVDF尼龍膜較NC膜柔軟、結(jié)實、靈敏度高,易于操作且蛋白質(zhì)結(jié)合能力強(qiáng),但背景也高,需要加強(qiáng)封閉。
 
  3、操作細(xì)節(jié):在實驗過程中需要注意操作細(xì)節(jié),如避免濾紙/凝膠/轉(zhuǎn)印膜/濾紙夾層組合中存在氣泡,以提高轉(zhuǎn)膜效率;確保上下兩層濾紙不能過大,避免導(dǎo)致直接接觸而引起短路等。
 
  蛋白印跡儀是一種功能強(qiáng)大且應(yīng)用廣泛的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究設(shè)備。通過正確使用和維護(hù)保養(yǎng),可以為科研人員提供準(zhǔn)確的實驗結(jié)果和可靠的數(shù)據(jù)支持。
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